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Un activateur enzymatique est une substance qui se lie à une enzyme et favorise son activité. C'est l'opposé d'un inhibiteur enzymatique. Ce sont des espèces chimiques souvent impliquées dans la régulation allostérique d'enzymes clés du métabolisme. Ainsi, le fructose-2,6-bisphosphate est un activateur de la phosphofructokinase-1 et accélère la glycolyse en réponse à la présence d'insuline. Autre exemple, l'acétyl-CoA est un activateur allostérique de la pyruvate carboxylase.
Dans certains cas, le substrat lui-même peut avoir un effet allostérique sur l'ensemble d'une enzyme en se liant simplement à l'une de ses sous-unités, ce qui a pour effet d'accroître l'activité catalytique des autres sous-unités de l'enzyme ainsi que leur affinité pour le substrat.
Un activateur peut également être un cofacteur. C'est par exemple le cas d'ions métalliques tels que l'ion chlorure Cl−, activateur de l'amylase salivaire, de l'ion magnésium Mg2+, activateur des kinases, et de l'ion zinc Zn2+, activateur de l'anhydrase carbonique ; certains d'entre eux sont considérés comme deuxième substrat.