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Les premières traces d’occupation humaine remontent à environ 6 000 ans : à cette époque le site d'Ossachite, nom choisi par les anthropologues, est peuplé par les Amérindiens Timucua et se trouve près du centre ville de l’actuelle Jacksonville.

Le premier Européen qui explore la région est le Français Jean Ribault, un huguenot qui découvre le St John en 1562. René de Goulaine de Laudonnière établit deux ans plus tard le Fort Caroline ; celui-ci est attaqué par les Espagnols depuis St. Augustine le 20 septembre 1565. Presque tous les occupants sont massacrés et le fort est rebaptisé Fort San Mateo.

Après la guerre de Sept Ans, la Floride est cédée à la Grande-Bretagne en 1763 par l’Espagne, mais cette dernière en reprend le contrôle vingt ans plus tard. Le premier établissement colonial permanent est fondé en 1791 sous le nom de Cowford parce qu’il constituait un guet qui permettait au bétail de passer le cours d’eau.

En juin 1822, soit un an après la cession de la Floride aux États-Unis par l’Espagne, elle fut renommée en l’honneur d’Andrew Jackson qui fut gouverneur militaire du Territoire de Floride puis président des États-Unis. Les colons américains s’installent dans la ville et Isaiah D. Hart rédige une charte municipale qui est approuvée par le conseil législatif de Floride le 9 février 1832.

La seconde moitié du XIX^e siècle fut plus propice à la croissance de la ville. Des bateaux à vapeur acheminaient alors les agrumes produits par les plantations locales vers les marchés extérieurs. L'industrie du bois et des produits résineux était également en plein essor.