Una amminoacil-tRNA-sintetasi (numero EC 6.1.1[1]) è un enzima che catalizza l'esterificazione di uno specifico amminoacido (o di un suo precursore) ad uno dei possibili tRNA corrispondenti, a formare un amminoacil-tRNA. Ne esistono 20 in ciascun organismo, una per ogni amminoacido codificato. Ciò significa che ogni gruppo di tRNA isoaccettori viene amminoacilato da un singolo enzima.
La ligasi lega inizialmente una molecola di ATP ed il corrispondente amminoacido (o il suo precursore), a formare un amminoacil-adenilato (con il rilascio di una molecola di pirofosfato), che resta adeso all'enzima. Esso lega successivamente la molecola di tRNA appropriata, spostando l'amminoacido dall'adenilato alla coda 3' della molecola del tRNA (in particolare il 2'-OH o il 3'-OH dell'ultima base, A76).
amminoacido + ATP → amminoacil-tRNA + AMP
- (amminoacido + ATP → amminoacil-AMP + PPi e amminoacil-AMP + tRNA → amminoacil-tRNA + AMP)
Svolgono un ruolo molto importante, in quanto dotate di un'elevatissima specificità di substrato che consente di legare l'amminoacido appropriato ai relativi tRNA isoaccettori. Si può dire che sono gli enzimi che operano la traduzione dell'informazione genica in quanto assegnano un amminoacido a ciascun anticodone del tRNA. Alcune sintetasi presentano anche attività di proofreading, per garantire il corretto appaiamento amminoacido-tRNA: se il tRNA risulta caricato erroneamente, il legame con l'amminoacido viene idrolizzato.